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羊驼抗半抗原重链单结构域抗体的分离及敏感性免疫分析

作者:张萌萌   来源:内蒙古骆驼研究院  已浏览【】次  文字:【】【】【

自从第一次放射免疫分析报告以来,已经开发出了无数的免疫分析,并证明它是广泛的物质如病毒、细菌、疾病生物标志物、食物毒素的体外诊断和环境监测的宝贵分析方法。以及环境污染物,包括内分泌干扰物和杀虫剂及其代谢物。对于应用于真实样品的免疫分析,其在检测基质中应具有高灵敏度和鲁棒性。这些特性在很大程度上取决于抗体对其目标分析物的高亲和力和特异性以及在基质中的高稳定性。单克隆抗体(MAbs)主要来源于小鼠杂交瘤细胞系,以及兔、山羊、绵羊和其他物种血清中的多克隆抗体(PAbs),是免疫分析技术中的传统试剂。

常规抗体(IgG亚类)平均分子量为150kda,由两条相同的重链和轻链组成,二硫键连接。每个抗体包含两个抗原结合囊。尽管PAbs很容易以较低的生产成本获得,但它们是有限的,这需要随后的抗体特性和分析优化,因为动物之间的免疫反应存在差异这可能是PAbs用于大规模生产或商业化分析的限制因素。从杂交瘤细胞株获得的单克隆抗体可以克服PAbs的重复性问题。一个已建立的杂交瘤可以无限期地产生单克隆抗体。然而,单克隆抗体技术昂贵,有时冻存的杂交瘤细胞系很难恢复,很难产生高质量的小分子单克隆抗体。由于功能性常规抗体的大小、对两条链的需求以及复杂的翻译后修饰,很难重组表达。许多源于抗体的蛋白质是完整抗体分子的衍生物,包括单价片段,如Fab、单链抗体,以及工程变体,包括糖尿病、三体、小体和单域抗体。然而,这些结构物通常具有较低的亲和力,比完整的抗体分子更不稳定抗体。由于表达的抗体片段的有限溶解度和聚集性会降低表达蛋白的产量,因此产生问题,由于VHsVLs的高度非功能性结合,杂交瘤细胞株噬菌体抗体库的多样性应该非常大,以增加选择理想抗体片段的可能性

1993年,Hamers Casterman在骆驼科成员(即骆驼、美洲驼和羊驼)中发现了一个新的抗体亚类,该亚类具有抗原结合囊,仅由重链的可变区域组成,完全没有轻链,这些重链可变结构域的重组表达产生单结构域抗体(VHH)。与其他重组抗体片段相比,VHHs的单结构域特性具有许多优点,特别是在各种表达系统中易于表达,热稳定性高,溶解性好,抗蛋白水解,与常规抗体相比,VHHs的抗原结合模式非常独特。由于传统抗体的结合区域由重链和轻链组成,它们倾向于通过大的表面积与蛋白质结合,并在重链和轻链的界面形成的深裂缝中包含小分子。因为重链抗体需要补偿缺失的轻链,它们的互补决定区3CDR3)通常较长,它允许形成手指状形状并随后结合在蛋白质靶的凹槽中。这允许重链抗体用作酶抑制剂。当结合到小分子时,它们的结合通过涉及三个高变环和框架区(FRs)还观察到,VHH与咖啡因的结合伴随着半抗原诱导的VHH二聚。

 

1.常规抗体与纳米抗体对比图片

迄今为止,有关VHHs在生物技术上应用的报道大多与蛋白质或其他大分子抗原有关,而很少有报道涉及小分子。已经开发了一些基于VHH的检测方法来检测小半抗原,但除了两个VHHS对偶氮染料反应的Re20和赭曲霉毒素A外,26μm范围的灵敏度对于实际样品的实际应用来说有点不令人满意。我们最近证明了VHHs对三氯卡宾的生成。(TCC)在骆驼免疫应答中不受欢迎,但高亲和力的抗TCC VHHs可通过竞争性选择从噬菌体库中分离出来。基于VHH的酶联免疫吸附试验显示IC50值为3.5 ng/mL。为了进一步验证这一假设并评估VHHs在实际应用开发中的潜力,本文报道了羊驼VHHs3-苯氧基苯甲酸(3ppa)(MW=214)的分离及其在人体尿液中免疫检测中的应用。3-PBA是拟除虫菊酯类杀虫剂的人体尿代谢物,可作为监测人类接触这些杀虫剂的生物标记物。我们以前已经开发了一种基于PAb的酶联免疫试剂盒(ELISA)检测3-PBA,同源的酶联免疫试剂盒的IC50值为120 ng/mL,异源的酶联免疫试剂盒的IC50值为1.6 ng/mL3-PBA免疫分析方法的建立,其灵敏度与常规PAbs相当,在实际样品中回收率高。由于VHHs易于生产,且不需要PAbs的逐批变化,因此在实际应用中展示其高性能是对小分子免疫分析技术的重要贡献。

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